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植物組織培養(yǎng)

一、原理

植物組織培養(yǎng)是指在無菌條件下，對離體植物組織(器官或細胞)分離并在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其能夠繼續(xù)生長，甚至分化發(fā)育成一完整的植株的一門實驗技術(shù)。組織培養(yǎng)的理論依據(jù)是植物細胞的全能性，即植物體的每個細胞攜帶著一套完整的基因組，因此具有發(fā)育成完整植株的潛在能力。植物組織當中原本已經(jīng)分化的細胞，一旦脫離原有的機體環(huán)境，成為離體狀態(tài)，在適宜的營養(yǎng)和外界條件下，就會表現(xiàn)出全能性，從已經(jīng)分化定型的細胞，脫分化，成為恢復分裂能力的細胞，并能重新生長發(fā)育成完整的植株。

愈傷組織是指一個離體的細胞、一塊組織或一個器官的細胞，通過脫分化不斷分裂、增生子細胞，這些細胞胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，顏色淺而透明，逐漸形成了無序結(jié)構(gòu)的一團細胞。

二、試劑及儀器

(一)儀器設(shè)備

超凈工作臺、高壓滅菌鍋、微波爐、人工氣候箱、電子天平、移液器(1-5ml)、恒溫磁力攪拌器、酸度計、手術(shù)刀、手術(shù)剪、稱量紙、皮筋、封口膜、三角燒瓶(500ml、100ml)、量筒、燒杯(1000ml)、試劑瓶(1000ml、100ml)、長鑷子、記號筆(或標簽紙)、培養(yǎng)皿、酒精燈、打孔器

(二)試劑

75%酒精、次氯酸鈉(或H2O2)、植物生長激素、蔗糖、脂粉、HCl、NaOH、KH2PO4、CoCl2?6H2O、煙酸、鹽酸-硫胺素(VB1)、鹽酸-吡哆醇(VB6)、肌醇、甘氨酸

三、實驗步驟

(一)培養(yǎng)基配制

1.培養(yǎng)基的選擇

植物組織培養(yǎng)中應用的培養(yǎng)基，一般由無機營養(yǎng)物、碳源、維生素、生長調(diào)節(jié)劑和有機附加物等五類物質(zhì)組成。

無機營養(yǎng)物包括大量元素和微量元素。大量元素：C、H、O、N、P、S、K、Ca、Na、Mg等，微量元素：Mn、Zn、Cu、B、Mo、Fe等。碳源一般為蔗糖。維生素中只有硫胺素是必需的，而煙酸、維生素B6和肌醇對生長之起促進作用。常用的生長調(diào)節(jié)劑有IAA(吲哚乙酸)、IBA(吲哚-3-丁酸)、NAA(萘乙酸)、NOA(萘氧乙酸)、P-CPA(對氯苯氧乙酸)、2，4-D(二氯苯氧乙酸)、2，4，5-T(三氯苯氧乙酸);BAP(芐氨基嘌呤)、6-BA(芐基腺嘌呤)、2-Zi(異戊烯氨基嘌呤)、KT(激動素)等。有機附加物是指甘氨酸、水解酪蛋白、椰子乳等，可促進分化，但如培養(yǎng)基配方適當，則大多數(shù)組織是不需要的。

培養(yǎng)基的種類、成份直接影響到培養(yǎng)材料的生長發(fā)育，故應根據(jù)培養(yǎng)植物的種類和部位，選擇適宜的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基種類繁多，較基本、較常用的培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基(見表1)。

2.培養(yǎng)基的配制

①先按表1配制MS培養(yǎng)基貯液，②再將貯液與其他成分按比例混合。③此外還需加入適量的蔗糖作為碳源，起支持作用的瓊脂粉，適量的生長調(diào)節(jié)劑等。④將上述培養(yǎng)基加熱溶解后，加蒸餾水使培養(yǎng)基達到終體積。⑤再用0.1mol/LNaOH或0.1mol/LHCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值至較適。⑥分裝至三角燒瓶，封口膜封口，等待滅菌后使用。

3.幾種誘導愈傷組織的培養(yǎng)基

胡蘿卜MS+0.5mg/L6BA+0.5mg/LNAA

玫瑰葉盤，芽MS+0.5mg/L6BA+0.5mg/LNAA

煙草葉盤、葉柄MS+0.1mg/L6BA+0.5mg/LNAA

pH5.8，蔗糖30%，瓊脂粉6.5g/L。

(二)滅菌

1.培養(yǎng)基及器具滅菌

培養(yǎng)基、無菌水需要在高壓滅菌鍋中滅菌。滅菌作用取決于溫度，常用的滅菌溫度為121℃，所需時間應隨要滅菌的液體的容積變化而變化(見表2)滅菌結(jié)束后待溫度下降到50℃以下，才能取出已滅菌的培養(yǎng)基。

可用同樣方法對器具同時進行滅菌，包括：培養(yǎng)皿、解剖刀、剪子、濾紙、鑷子、打孔器等。

2.工作環(huán)境滅菌

接種前1h打開超凈工作臺和棚面的紫外燈照射40min。殺菌結(jié)束后，先關(guān)掉棚面的紫外燈，再打開風機，較后關(guān)掉超凈工作臺上的紫外燈。在接種后休息時，要先打開臺面的紫外燈，再關(guān)風機，較后打開棚面紫外燈。不能將風機與臺面上的紫外燈同時關(guān)閉或先關(guān)閉風機再開紫外燈。

3.植物材料的滅菌

植株各部分的表面攜帶著各種微生物，他們是植物組培的污染源，所以在接種培養(yǎng)前必須進行徹底的表面消毒;組織內(nèi)部侵染的真菌或細菌很難消除，這些組織一般淘汰不用。消毒前需用流水清洗植物材料表面污垢，再用無菌潔凈濾紙吸干水分。

文章來自:園林網(wǎng)