高純度銀杏葉提取物、2010版銀杏黃酮、銀杏酮

銀杏(GinkgobilobaL．)又稱白果樹，是地球上生長著的較古老的高等植物之一。銀杏葉中主要含有黃酮類和萜內(nèi)酯類兩大類有效成分，它們具有擴張血管、增加血流量、改善血液循環(huán)動力障礙、降低腦血管阻力、抑制血栓形成及清除人體自由基等多種作用。尤其銀杏內(nèi)酯B是目前發(fā)現(xiàn)的較有效的特異的血小板活化因子(PAF)拮抗劑，已成為世界多國醫(yī)藥專家的研究熱點。目前人們主要從銀杏葉中提取銀杏黃酮和萜內(nèi)酯，但由于銀杏黃酮和銀杏內(nèi)酯的含量很低，尤其銀杏葉中較主要的有效成分銀杏內(nèi)酯B主要存在于根中，在銀杏葉中含量極低(＜0.1％)，且是在生長狀態(tài)的葉中含量較高，采葉影響樹的生長；又因銀杏葉中主要的有效成分受多種因素的影響又有很大差別，銀杏葉革質(zhì)化、蠟質(zhì)化程度高，使得國內(nèi)銀杏葉提取物的質(zhì)量很難達到國際標(biāo)準。同時，銀杏的大面積栽植占據(jù)了大量珍貴的耕地面積。為此，本研究利用植物細胞工程技術(shù)建立了銀杏幼葉愈傷組織無性系和細胞懸浮培養(yǎng)系，并對銀杏細胞懸浮培養(yǎng)系進行了多代篩選、馴化，對其培養(yǎng)條件的生理、生化調(diào)控進行了大量研究，建立起了生長旺盛且具有高黃酮和內(nèi)酯含量的優(yōu)良的銀杏細胞懸浮培養(yǎng)系。實驗中發(fā)現(xiàn)基因型、外植體類型、樹齡和季節(jié)等諸多因素對銀杏愈傷組織培養(yǎng)物中的黃酮和萜內(nèi)酯的含量都有較大影響。應(yīng)選擇樹體自身黃酮和內(nèi)酯含量高的樹種，在4月中下旬銀杏葉剛萌發(fā)時取3～5年生的幼樹的嫩葉為外植體進行愈傷組織的誘導(dǎo)。通過對培養(yǎng)基種類、多種不同濃度的激素組合、紫外線照射、培養(yǎng)過程的溫度和光照等條件的研究，采用分光光度法和HPLC法相結(jié)合的方法篩選出了銀杏黃酮和萜內(nèi)酯含量都較高的銀杏幼葉愈傷組織無性系。由于在固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)的愈傷組織生長速率較慢，不適于培養(yǎng)物中目標(biāo)次生代謝產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)，實驗中又進一步以固體培養(yǎng)基上的愈傷組織無性系為材料建立了銀杏細胞懸浮培養(yǎng)系。對銀杏細胞懸浮培養(yǎng)系的生理、生化調(diào)控研究結(jié)果表明：以B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加NAA0.5～1.0mg／L、BA0.2～0.5mg／L、30g／L蔗糖和15g／L葡萄糖，培養(yǎng)液pH值為5.8～6.2，培養(yǎng)基中Cu~(2+)提高十倍，F(xiàn)e~(2+)濃度增加0.5倍，氨態(tài)氮加倍，硝態(tài)氮減半，以30～40FWg／L的接種量接種于裝有50ml培養(yǎng)液的150ml三角瓶中，置于25±1℃、3000Lux連續(xù)光照條件下進行懸浮培養(yǎng)，大連理工大學(xué)博士學(xué)位論文在培養(yǎng)的第15天加人0．ito．2叭的苯丙氨酸，在培養(yǎng)的第20天收獲，較有利于銀杏細胞懸浮培養(yǎng)系中黃酮和格內(nèi)酯的生產(chǎn)。細胞懸浮培養(yǎng)物中黃酮含量可達3．35％，前內(nèi)酯含量可達0．0758％。本實驗還對銀杏葉及銀杏組織細胞培養(yǎng)物中有效成分的提取、純化和檢測方法進行了研究，發(fā)現(xiàn)將銀杏葉粉碎成40～60目，在料液比為1：15的情況下以70％乙醇為提取溶劑，先湖預(yù)處理205，然后用超聲波強牌取stnin，重復(fù)操作2次，銀杏葉中有效成分提取率可達98．5％。GBE粗提液經(jīng)液一液法去雜后，將提取液中黃酮濃度稀釋為1．ul．Zmtw左右，再以10倍柱體積的提取液控制吸附流速為4倍樹脂柱體規(guī)用HPD00大孔吸附樹脂吸附，吸附完全后依次用去高于水、20％乙測滌，再用流速為2倍樹脂柱體肌的90％乙醇解吸的方法獲得的GBE精提物經(jīng)分光光度法和HPLC法檢測黃酮著為26．l％，蔬內(nèi)酯為6．2％，達到國際標(biāo)準。對銀杏黃酮提取液采用微波強化水解、HP＊C檢測：對銀杏內(nèi)酯采用10％甲醇回流提取、單柱層析純化、y－pLC分析和二極管陣列檢測器檢測，以上方法減少了樣品的預(yù)純化時間，且操作簡便，易于掌握，可在短時間內(nèi)檢測很多樣品。這將為以銀杏葉提取物為主要原料的廠家對其產(chǎn)品中有效成分含量的測定提供極大的方便。

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